服务
中心
登录
收藏
联系

  • 官方微博

  • 微信订阅

  • 兴趣部落
通知
分享
建议
顶部
收起

PCR的前世今生(中)

发布时间:2015-09-01作者:徐九洋

There was a time when to amplify DNA,

You had to grow tons and tons of tiny cells.

Then along came a guy named Dr. Kary Mullis,

Said you can amplify in vitro just as well.

Just mix your template with a buffer and some primers,

Nucleotides and polymerases, too.

Denaturing, annealing, and extending.

Well it’s amazing what heating and cooling and heating will do.

PCR, when you need to detect mutations.

PCR, when you need to recombine.

PCR, when you need to find out who the daddy is.

PCR, when you need to solve a crime.

这首有爱的《PCR之歌》,想必大家都听(说)过。那么神奇的PCR是怎么被发明的呢?本篇将继续讲述K.B. Mullis发明PCR技术的科学故事


1.jpg



——PCR的发明过程

潜心钻研PCR技术?

      实际上,我们的大博士Mullis根本谈不上“潜心钻研”,PCR并不是他的研究主攻方向,其实他也并没有什么主攻方向。从他的大脑里,一直能够蹦出一些“鬼点子”来,PCR的发明也并不例外。

有一个周末他开车载着女朋友行驶在蜿蜒的盘山路上时,又一个“鬼点子”蹦了出来,这就是P-C-R。

1979年秋,Mullis进入旧金山的Cetus公司工作,负责DNA合成部门的工作。因为技术的革新,短片段DNA的合成效率大大提高。

由于自己的工作比较清闲(“我制造出来的DNA片段公司其他研究人员根本用不完”),于是他开始帮隔壁实验室的人思考如何检测基因组中的单碱基突变。

Mullis对于这一问题的思考堪称“伟大的思考”,因为其中一个想法演化成了PCR技术,另一个想法与1980年获诺贝尔奖的Sanger测序有着异曲同工之妙。

2.jpg

研究问题似乎并不需要自己提

      Mullis的隔壁是Henry Erlich的实验室,研究方向是找到检测基因组点突变的方法。Mullis由于比较清闲,加上Erlich实验室经常从他这里定制DNA短片段因而两人比较熟悉,所以Mullis自然就开始了“思考别人的问题”的过程。

      对于这个课题,Mullis曾提出一个叫做“oligomer restriction”的方法,非常类似于Sanger测序的原理:将一个DNA短片段结合在待测碱基的上游,随后利用放射标记的双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)为原料,在体外进行DNA复制。由于ddNTP的特性,DNA复制会停在ddNTP结合的位置;接下来只需要依次放射标记四种ddNTP,再通过跑胶观察就可以得知待测位点的碱基是什么了。

3.jpg

     其实只要再加上分辨率达到一个碱基级别的PAGE胶,这就是Sanger测序了。在这一伟大技术的延伸应用的过程中,他阴差阳错撞上了PCR。(天呐,怎么运气那么好~)

      我们继续回到故事里面。理论上这一检测方法是可行的(不就相当于是测序吗,当然可行咯~),但是依当时的条件在人基因组里面完成却有很大的难度。

      因为,在人基因组里面,待检测的基因只是单拷贝的(因为是检测突变),模板的量实在太小了,不能保证引物的结合效率;即便是成功地结合上去了,当时的检测灵敏度水平也不足以检测到单条DNA链上的信号吧。

      对于现在的实验室来说,这并不是一个问题,只需要对模板进行PCR扩增不就行了?

      的确,Mullis的方法所欠缺的正是一个能够高效扩增DNA片段的方法,也就是PCR。

接下来你可能会预设这样的一个剧情:由于意识到自己方法的局限,所以Mullis开始查找文献,并苦思冥想高效扩增DNA的办法,随后在努力之下发明了PCR……

4.jpg

如果是这样,那么这个剧情走向也实在是太教科书般地美好了,但是事实上故事并没有这么简单。

实际上,我们的主人公Mullis连他的这个方法的致命弱点——模板链需要扩增都没有意识到,他还在想着怎么完善他的所谓Oligomer Restricion的技术细节呢。

突发奇想:当汽车行驶在蜿蜒的公路上

      网上流传的很多版本的故事都会说,有一天当Mullis驾车行驶在蜿蜒迂回的公路上时,DNA片段不断变性-复性-延伸复制的情景在他的脑海里涌现,于是他发明了PCR。但是,细读他自己在诺贝尔奖颁奖典礼上的回忆,便能发现故事远比这个要有趣的多,且听我慢慢讲来。

Mullis在旧金山的郊外山里有一间小木屋,他通常会在那里度过周末的时光。1983年春天一个周五的晚上,他向往常一样开车载着同事兼女友Jennifer前往小屋度周末。

      在开过蜿蜒山路的时候,他又开始琢磨他的检测单碱基突变的方法。这一次他想到的点子是,既然结合一条引物是可行的,为什么不试试看同时结合两条引物呢,反正对于他自己来说最不缺的就是DNA短片段(这一点似乎是Mullis的优势所在,有材料任性&奇思妙想)。

Mullis开始在脑海里模拟这个实验:

“设计两条引物,分别结合在DNA的正义链和反义链上,且这两条引物的3’端均位于待测碱基的上游1个碱基的位置。
“这样,当进行Oligomer Restriction检验的时候,两条链上都会延伸结合上相应的ddNTP;
“只需要在原先设计引物的时候将两个引物的长度设计得不一样,得到的两个产物就能够在DNA胶上被区分开来。
“很好,到目前为止都没有问题。
“这样,一次检测就能同时得到两个结果,这两个结果可以互为对照组,如果两条链的结果得到的碱基可以互相配对成功,那么证明实验体系没有问题,结果可信;反之,如果两条链结果不一致,那么很有可能是实验过程中出现了问题。”

      看到这里,你可能都为我们的主人公着急,两条引物的思路,这不就是PCR吗!

当然,对于我们来说再简单不过,但是对于当时尚在黑暗中摸索的科学家来说,还需要经过一番思考才能点破这层窗户纸。

5.jpg


Mullis对于他自己想到的这个几乎“零成本”的对照组设计非常满意。

高兴之余,他开始继续模拟实验:

“如果混入了dNTP,那么聚合酶在延伸DNA链时则会有时用dNTP有时用ddNTP,使得ddNTP结合的位置就变得不确定,通过他的对照组的设计就能够检测出来,该组实验结果不能采信。
“很好,对照组的效果不错。那么,有没有什么办法可以避免dNTP的混入呢?
“不如用碱性磷酸酶(BAP,Bacteria Alkaline Phosphate)呢?用BAP除去原有混合物里面的磷酸基团,随后再加入ddNTP开始反应,这样应该不错。
“不过得想个办法在加入ddNTP之前除去BAP的活性,简单,对于蛋白质来说加热就行。
“等等,好像BAP的热变性是可逆的?”

6.jpg

      看到这里,似乎Mullis的思路离PCR的发明越来越远了,在最接近真理的一刻他转而开始思考其他细小分支上的问题,并且差点错过了PCR的发明。不过还好,他在分子生物学领域的一定程度上的“无知”帮他顺利转回了轨道。

无知并不总是一件坏事!

      Mullis发明PCR的故事,颇有一些误打误撞的意味:之前正是由于没有意识到模板浓度对于单碱基检测的致命影响,让他能够继续思考这个问题;而此时,也正是由于对BAP这个酶性质的不了解,使得他果断从岔路回到了正道上。

   “BAP的热变性是可逆的”这一观点,源于验证“蛋白质的三维结构由其一级序列决定”的实验,这一经典的实验就是用BAP完成的。不过,Mullis只是听说了这一实验,而并没有花一点时间仔细读一读原始文献。如果他读了文献就会知道,BAP的可逆热变性,与溶液中Zn2+的存在有关;如果去掉了Zn2+,BAP变性之后就不能恢复了。

      不过,如果Mullis确实读过原始文献,那么他就会在检测单碱基突变这条路上“一条路走到黑”,而没有机会考虑模板扩增这件事情了。

      由于一时想不到好的解决办法,于是Mullis便开始想,那么就先这样吧,让那些混入的dNTP先留在反应体系里面,看看会发生什么事。于是,在那条漫长的公路上,他又开始继续他的思维模拟实验。这一次,他碰到了真理——PCR


中国康复器具协会 | 中国医疗器械行业协会 | 中国医学装备协会 | 国家食品药品监督管理总局 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 |  中国医疗健康产业发展策略联盟 | 中华医学会