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PCR的前世今生(下)

发布时间:2015-09-01作者:徐九洋

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EUREKA时刻!

      当Mullis继续想着他的模拟实验的时候,他距离真理已经越来越近了。如果原先的反应体系里面混有dNTP,那么不妨先加入DNA聚合酶让反应发生,这时dNTP就会被作为原料完成DNA复制的反应;而此时只需要加热使DNA双链变性,再冷却复性时由于引物的量很多,因此原来的DNA链与引物结合的可能性最大,这样就达到了“去除dNTP”的目的。

      但是,如果dNTP的量比较多,延伸得比较长,使得变性复性之后,新合成的链与下游的反向引物结合了呢?

      EUREKA!这样也没有关系,不就是模板链加倍了吗!单碱基突变检测照常进行!

      EUREKA!那么我可以有意多加引物保证模板链复制以提高效率!

      EUREKA!如果像这样一遍一遍重复,那么模板DNA就可以不断复制扩增了!单碱基检测的效率就大大提高了!

      三次EUREKA时刻之后,Mullis赶紧停下车,从工具箱里面找到纸笔演算他的想法。2的10次方是1000,那么20次方就有106,那么30次方就有109,只需要30个循环就能接近人基因组的碱基数目了。经过这样的处理之后,再进行检测就可以信号非常清晰且没有背景杂音。

      算到这里,Mullis回到了车里继续上路。车没开出去多远,又一个重要的想法进入了他的脑海。虽然这个时候他没有再喊出EUREKA,但是这的确是最好的EUREKA时刻:其实刚才这些想法和单碱基检测可以没有任何关系,只要设计好引物准备好反应原料和体系,不就能够高效扩增DNA片段吗!(终于被你发现了^_^)

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      Mullis兴奋得彻夜未眠,他的演算草稿遍布小木屋的每一个角落。终于等到了周一,Mullis回到了公司;令人兴奋的是,经过图书馆检索,他并没有查到任何前人关于这个想法的记录。这让Mullis陷入沉思,是不是自己的想法中隐含着特别简单的错误呢?否则为什么如此简单的方案这么长时间都没有人提出来?

      于是Mullis开始给Cetus其他的科学家们讲他的想法,但是除了他的女友Jennifer以及为数不多的几个技术员之外,其余的人都对他的想法并不感兴趣。不过同时,他的同事们也并不能从他的设计里面挑出任何漏洞。也就意味着,很有可能方案可行。

      这时他打开电脑,在专门存放他的奇思妙想的文件夹里面新建了一个文档,并且命名为Polymerase Chain Reaction(PCR)。

      接下来就是实验验证了,好事多磨,在实验中他也经历了一些挫折。PCR引物合成对于他来说再简单不过了,Mullis只需要用他自己办公室里面的机器合成就好。模板的选择上,开始他选择刚被克隆出来的神经生长因子基因,但是一直不能成功;后来他觉得人的基因过于复杂,而且提取出来很可能不纯,所以果断换用更简单的质粒PBR322。反应条件的选择上,开始时他并没有反复加热-冷却,而是从化学热力学的角度认为,只要把原料堆在一起,双链就能可逆地分开并且与引物结合;后来,在不断尝试调整之后,当年的12月16日,实验终于成功了。

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      随后1984年Mullis和Cetus公司对于PCR技术申请了技术专利,并且撰写了文章发表。由公司撰写的关于PCR技术应用的文章很快在Science上刊发;但是由于种种原因,Mullis撰写的PCR原理的文章先后被nature和Science拒绝,最后只能发表在不知名的Methods of Enzymology (《酶学方法》)杂志上。

      瑕不掩瑜,最终Mullis仍然作为PCR的发明者被世人认可,并且在1993年获得了诺贝尔化学奖。原先找不到工作而四处辗转的小混混,现在成为被各地邀请讲演的大教授了。

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写在最后

      关于K.B. Mullis的各种花边故事,网络上流传了有很多,并且对于他的评价褒贬不一。有人觉得他提出PCR想法之后过了好几个月才进行实验,其中必有蹊跷;也有人说他因为沉迷于电脑和儿女情长而耽误了论文的撰写,若不是专利证书上有他的名字,诺贝尔奖委员会可能根本不会注意到PCR的发明者竟然是这位只在小期刊上发表文章的作者的。

      抛开这些花边的信息不谈,回顾PCR发明的科学历程,还是非常有趣的。

      通常我们研究一个科学问题的思路,是提出一个重大的科学问题(Question),找到一个适合的研究体系(System),并借助于相关的技术(Technique)进行实验探索与猜想验证。反观Mullis发明PCR的过程,他本人并没有提出什么科学问题,而是借着隔壁组的问题研究下去;即便是自己提出了一些有待解决的小问题,他相对缺乏的专业知识也将他挡在解决问题的门外;他的大部分时间也并没有花在实验室里面,而是一次漫长驾驶当中的思维模拟实验帮助他获得了灵感……

      似乎,整个的过程中颇带有运气的成分, PCR这个点子径直撞进了Mullis的脑海。不过,如果不是这个思维极度发散,同时又善于抓住重要问题的“科学怪才”,即便是好点子送上们来也只怕会擦肩而过了。

      读了Mullis的故事,对于你的科学研究,有什么启发呢?至少有一点,不要轻易放弃那些“鬼点子”吧。


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