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血细胞分析仪50年发展历程和未来展望

发布时间:2015-07-01作者:张时民

      1590 年荷兰人米德尔堡和詹森设计制造了最原始的显微镜,1610 年伽利略使用望远镜观察小的物体并将其放大,后来被列文霍克改进成为原始的显微镜。1658 年意大利人马尔皮基应用最原始的显微镜首先观察到了红细胞,他是第一个见到红细胞的人,开始进行红细胞计数则是200 年后的事情了。而设计并生产出第一台血细胞计数仪则又过了近100 年。 

     自从发明了显微镜以后,人们从微观世界中了解和观察到了血液的组成,并根据他们的特点分别将它们称为红细胞和白细胞和血小板。在以后的研究中,人们发现许多疾病的发生和发展与血液中的细胞数量之间存在一定的关系。依据对疾病诊断的需求,人们开始寻求对血液中细胞的数量进行计数。1852 年就有人开始设计对红细胞的计数办法,1855 年发明了用于计数血细胞的计数板, 目前仍然使用的改良Neubauer 计数板就是应用最为广泛和持续时间最为长久的经典一种,虽然各种类型的血细胞计数仪已在广泛使用,但血细胞计数板法仍然是最为可靠和最为经典的计数技术,它不仅适用于血细胞计数, 还可用于其他细胞、动物血细胞、微小粒子及需要在显微镜下计数的各种样品,因此计数板仍然是检验工作者应该掌握的基本技能,是不应该忘记和放弃的手段。 

血细胞.jpg

      随着对血细胞计数和分析需求的不断增加,对血细胞计数的方法进行改进,实现自动化、高速度、准确性、标准化和智能化的要求也越来越高,现代的血液细胞分析技术与50 年前的发明虽然有着本质上的相同或相似,但已经有了显著的飞跃。作者力图通过有限的资料对细胞计数和分析技术的发展进程进行回顾,并对最新的进展进行介绍和展望,期望对关注这一领域和从事血细胞分析工作的同行有所帮助。 

一、血细胞计数仪的发展历史 

谈到血细胞计数仪的发展史,在这个领域首开先河的人是1912年出生在美国阿肯色州一个小城的人Wallance H. Coulter,他年青时对电子学非常感兴趣,最初是一位广播电台的电器工程师,后来做过X光机的销售员和维修工程师,在亚洲许多国家包括我国的上海工作过。1948 年他在芝加哥一家公司工作时,在一间地下室建立了自己的实验室,开始秘密的从事自己的实验,这项实验导致了一个重大的发明,他发现了微小粒子通过特殊的小孔时可产生电阻变化这一现象,并根 据这种电阻变化特点将其应用于微小粒子的粒度测量和计数上。科技界为表彰他的发明,将其称为库尔特原理(Coulter principle )。根据这个原理,Coulter 先生将其引入到血液细胞计数上,在1953 年获得美国发明专利,同年和他的兄弟约瑟夫(Joseph )开创了自己的公司,并成功的设计和制造出了可以计数血细胞的专用仪器,然后开始了在这一领域的商业运作。这种仪器看起来非常原始和简单,好象一个示波器另加一些管道、电极和瓶瓶罐罐 。它的计数原理是根据血细胞的不良导电性和产生电阻抗原理来计数血液中的细胞,也就是电阻式血细胞计数原理,这种原理现在已经成为血细胞计数和分析中最为经典的原理。 

最初的血细胞计数仪是一种单参数测定仪器,只能对血液中的红细胞和白细胞进行计数,并且需人工切换。最早生产的血球计数仪为Coulter A型,笔者曾经见到和使用过Coulter D型,那是一个黑色外壳的长方型仪器,它的前面有一些调节轮盘,右下方有一个可以升降的样品台,它通过U型水银管控制计数时间和计数容量,外侧安装有一个窥孔器(用于观察计数小孔是否有堵塞的放大镜),通过数码管显示结果,通过切换按键选择白细胞还是红细胞计数的简单仪器。1958 年以Coulter 命名的专门从事颗粒性测量和计数的仪器公司,库尔特电子(Coulter Electronics )公司成立。 

此后,欧洲、日本也开始了血液细胞计数仪的开发和研制,我国在60年代中期也开始了这种仪器的开发和生产。例如日本Sysmex 公司1962 年就生产了可进行红细胞和白细胞计数的CC-1001 型血球计数仪,我国1965年在上海也生产了简单的血细胞计数仪,1975 年北京医疗仪器厂也开始模仿设计自己的简单的红白细胞计数仪。到目前为止已经有许多国家开始生产各种类型的血细胞分析仪,经过半个多世纪的发展,这种仪器已经有了非常明显的进步。以前因为只能进行细胞计数,因此我们一般将这类仪器叫做血细胞计数仪(Blood Cell Counter),由于技术的进步目前这类仪器可以提供除了血细胞计数以外的更多参数的联合测定和分析,因此我们一般将这类仪器统称为血液细胞分析仪(Hematology Analyzer) 。 

经过多年的发展,特别是近年来电子计算机技术的发展,血细胞分析仪无论在技术上、形式上、功能上、参数上、用户界面上等许多方面都有很大的改观和进步。 

因人所共知的原因,我国和美国在50年代基本没有任何贸易往来,因此英国进口的EEL型血球计数仪应该是国内引进比较早的血球计数仪。协和医院检验科在60 年代初期就引进了这样一台仪器,该仪器是具有代表性的早期采用光学的细胞移动型血细胞计数的仪器,也是最早使用光学法和壳流技术的仪器。血细胞在流动的壳液的带动下经过光轴的中心,在暗视野下呈现出明亮的光脉冲信号,通过对这个信号的收集和分析来计数血细胞。该仪器的特别之处是稀释倍数和人工计数法一致,当仪器出现故障时,将标本滴入计算板仍可实施人工计数。该仪器体积较大,并缺乏备件,在80年代初期停止了使用,遗憾的是笔者没有找到该仪器的资料照片。 

二、血细胞分析仪发展中的技术进步 

随着各种技术的不断进步以及实验室工作对仪器设备需求的不断增加, 血细胞分析仪的各项用途和用法也有不断的进展,这首先体现在仪器应用的方便性、准确性和尽可能增加的参数上。 

1、稀释技术的进步: 早期的仪器一般要求在测定前先进行人工稀释,因此许多操作要求直接取20~40ul 的末梢血加到稀释液中。白细胞稀释比例多在1:251 和1:501倍,红细胞则需要进行二次稀释, 稀释倍数在6.25~25万倍之间, 然后再将稀释好的标本放入计数杯内进行计数,而且需要在白细胞稀释悬液中加入溶血剂。由于人工稀释费时费力且精确性差,随后的一些血细胞计数仪增加配置了专用的稀释器, 专供该型号的仪器进行机外稀释,这样减少了人工稀释带来的误差和麻烦,提高了效率。这类仪器的典型例子有国内应用非常普遍的SysmexF820 型, 此型号仪器到目前仍有市场需求并在广泛使用。现代的血细胞分析仪则更加先进,已经将自动稀释技术,自动进样方式全部添加到仪器本体内,即提高了技术含量、取样和稀释的精确度,使得进样的速度和可操作性更加方便,同时使得检测速度加快。

2、分析参数的增加:前面谈到早期的血球计数仪仅能进行红白细胞计数, 而且是需要通过切换分别进行红白细胞得计数, 所以将其称为血细胞计数器是恰当得。由于血常规检验对血红蛋白测定的需求增加,沙利比色法由于精度和操作不便不能满足临床需求,已经有单独的血红蛋白比色计配备,将加入专用的溶血剂后的样本进行白细胞计数后再将其倒入血红蛋白比色计, 即可得到比色法测定的血红蛋白结果。此时期国内使用最多的血细胞计数仪是Coulter ZF 型和血红蛋白计。由于对血红蛋白测定要求的增加,因此在仪器内增加一套比色装置,就可方便的测定血红蛋白。电阻法定细胞数量的同时还可对细胞体积进行测定,因此对红细胞平均体积(MCV)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)测定和计算也成为血球计数仪的标准参数。1975 年日本东亚公司(TOA, Sysmex 的前身) 推出了包含以上7 个参数的全自动血细胞计数仪器CC-710 和CC -720 型。 

3、血小板计数功能的增加:血小板是血细胞中最小的粒子,早期的血细胞计数仪均不包含血小板计数。60 年代起国外开始研制血小板计数仪,70 年已经有比较成熟的产品,这类仪器一般需使用PRP 血浆进行, 即使用特殊的离心速度将红细胞和白细胞进行沉淀,使上层血浆中尽量保存最为丰富的血小板,然后应用这种PRP 血浆进行血小板计数,例如Sysmex PA-701 型和CONTRAVE 1000 型,此类仪器多配有专用PRP 离心机。使用全血方式和水动力聚集方式计数血小板的仪器如Clay-Adams 的Ultra-Flo100 型以及80 年代后出现在我国的Baker S-810 型血小板分析仪,该仪器设定了单独血小板分析测量通道,根据红细胞和血小板体积的显著差异他们区分开,将血小板按体积大小划分到64 个通道,分别累加体积大小不同的血小板数量。它通过直接吸入稀释好的血细胞悬液进行测定,除了给出血小板数量外,还提供了两个新的参数,平均血小板体积(MPV) 和血小板体积分布宽度(PDW)。在这之后血细胞分析仪将血小板计数这一重要功能合并到全血细胞计数(CBC) 范围内。当时的仪器有很多型号,例如Baker 8000, Sysmex CC-800,Coulter S 系列和T 系列等。 

4、定量部的改进:仪器为了准确进行细胞计数,除了要准确稀释血液外, 对直接进入计数小孔内的液体量也要进行定量控制,因此仪器对定量部的要求是非常严格的。在血细胞计数仪开始阶段, 人们设计了U型水银管压力计,通过水银的重量和在两个电极间的距离来控制吸入的标本量。后来人们通过两只光电管来了解液体通过一个固定距离所需要的时间和容积来控制标本的吸入量,还有一些公司设计并使用了微量注射器技术以及浮球定量技术来控制计数样本的量。最新的光电计时容量控制技术控制标本进入计数区的量,可以使得进入计数区域的细胞悬液定量更加准确和无污染、同时还可判断小孔是否出现堵塞或半堵塞问题,以及便于维护。 

5、自动取样技术: 由于仪器需要对全血进行自动取样和稀释, 因此取样量也同样需要精确控制。最初的仪器是需要进行手工取样和稀释的,后来逐渐有了外置式专用取样稀释器。再后来仪器内部设置了内置式负压取样稀释器,根据负压量的大小来吸取血液样品,这对控制负压的精确度要求很高,此外还有微量注射器取样技术,依靠光电管控制血液取样量的技术等。目前认为采用旋转阀取样技术是比较精确的方法,旋转伐内部有多个按一定体积设计的小孔,当血液进而后,旋转伐从吸入的小孔转向排出的小孔,此时血液不能再进入,而孔内保留的固定量的血液进入仪器的稀释部,然后清洗,再进入下一次循环。目前许多更加先进的血液分析仪均采用陶瓷制的旋转阀来分配血液标本。 

进样方式也从最初的单一预稀释方式,演化为预稀释和全血方式两者兼有。现在许多先进的五分类血液分析仪还采用了更多种进样方式,例如Sysmex XE-2100 和Bayer Advia 120 型,如末梢血方式、开盖手工进样、闭盖手工进样、急诊检验进样、全自动进样等方式以及连接到全自动流水线的自动进样技术等。进样设备有的采用旋转式进样盘,如MEDONIC CA570和SWELAB AC920/970, 这种旋转式进样器多是选配件。更多的血液分析仪采用了平推式的自动进样系统,即将待检样品插在专用试管架上,仪器将试管架一步步送入仪器的取样口,测定完毕后自动推出。平推式自动进样系统在有些厂家的仪器上是可选择的配件,而在某些仪器上则是必备件。 

5、仪器的清洗技术:最初的仪器的清洗靠人工浸泡或使用毛涮清洗,如果测定完一个很高值的标本,则需要用空白液清洗一下,以防止对下一个标本的携带污染。而现在许多仪器在完成一个标本的检测后可自动对计数小孔、管道进行冲洗,还可同时对取样器、稀释器、取样针内外进行全面清洗,减少交叉污染的机会。许多仪器在开机和关机时可自动执行清洗程序或按事先设定的清洗程序进行定时清洗,保证仪器正常工作。 

6、小孔管技术的改进:小孔管是血细胞分析仪进行计数的关键部件,早期的仪器一般仅有一个直径为100μ的小孔管,多使用宝石经过激光精确打孔,然后镶嵌再玻璃支撑物上。现在多数电阻法仪器的小孔管在白细胞检测上使用直径为100 μ的小孔管,在红细胞和血小板检测上使用直径为60~ 80μ的小孔管,材料有宝石和特殊陶瓷等构成。例如经典的COULTER 外置式小孔管,当发生堵孔时可用毛刷清理或直接拆下来清洗。早期的小孔管一般暴露在外边,其主要目的是便于人工清洗,多为单管方式,进行白细胞到红细胞计数转换时最好清洗一下。后来发展为红细胞和白细胞各自独立的两个暴露在外的小孔管,一般20秒即可同时完成红细胞和白细胞的计数,需人工使用加样器或定量吸管从白细胞稀释悬液中进行红细胞的二次稀释或使用配套的稀释器。目前的仪器小孔一般采用内置式,减少了污染的机会并同时提供了自动清洗功能,使得每次计数后都能提供自动冲洗,减少了交叉污染的机会同时计数的速度也有了很大提高。  

为了更加准确的对细胞计数和防止各种干扰发生,各公司在小孔管的改进和设计上使用了不同的处理方案。这些技术有力的保证细胞计数准确,特别是血小板计数的准确性。 

(1)扫流技术(Sweep Flow): 为减少已通过计数小孔后由于液流的回流而重新返回计数区造成重复计数,在小孔后面增加一个扫流液系统,将计数过的细胞通过扫流液冲进废液管道。

(2)防反流装置(Von Behrens): 为防止细胞返回到计数敏感区,在小孔后面加一个带孔的当板,用负压将已经计数过的细胞阻挡后直接收集到废液管道中。  

(3)水动力聚焦技术(Hydrodinamic Focusing): 是目前认为最为有效的方法,也叫鞘流技术。它利用流体动力学原理,即可保证细胞位于鞘液中心并排成一列通过检测孔中心或通过激光束中心,又保证它不会返回敏感区,目前许多较为高级的血液分析仪一般采用此种技术。

7、其他用于保证计数精确性的技术: 

(1) 脉冲编辑功能(Pulse Edit): 可防止因细胞未从小孔中心通过而产生的脉冲改变并对其进行技术性修正,以得到准确细胞计数和体积测定结果。 

(2) 三次计数技术或多段计数技术(Voting):采用同时进行三次计数取平均值的做法或将总体计数时间分为多段进行统计,如果各段之间差异不大,可直接给出准确结果,如果差异稍大则进行提示或报警,如果差异明显则不给出结果,因而保证了计数结果的质量和准确。 

(3) 重叠校正技术(Coincidence Correction):通过仪器的逻辑电路和数学计算以及按照计算公式将重叠校正公式编入仪器的测定程序中,当出现两个细胞同时通过小孔的现象时,仪器就会很容易进行判断、运算处理后将结果校正过来。 

(4) 浮动界标技术(Floating Threshold):为保证血小板计数的准确,浮动界标将根据红细胞和血小板分布曲线的交界处寻找最低点,将此点作为红细胞和血小板计数的分界线,这样可以很好的处理过多小红细胞对血小板计数的干扰问题。 

(5)拟合曲线技术(Fitting Curve): Coulter公司设计的血小板计数范围是2~20fl, 为排除噪音干扰和小红细胞干扰, 根据正常人血小板体积分布呈对数正态分布的理论, 通过电子曲线拟合将没有被计数的大血小板计算在内,得到既无噪音干扰又无小红细胞影响的准确血小板计数结果。 

(6) 延时计数计数(Extended Count):当细胞数少于特定值时,仪器自行重复计数,以保证获取更多的细胞数,以减少统计学误差得到更加正确的结果和直方图形。 

8.各种故障处理功能的进展: 任何一台血液分析仪都会有故障,而简单的故障处理方法和程序将给用户带来方便。 

(1) 堵孔的处理: 堵孔为最常见原因,在没有处理程序前, 人们是通过毛刷来清洗小孔的。后来仪器设置了自动排堵功能,通过负压或正压,使用清洗剂对小孔的内外进行强力冲洗来排除堵孔。后来发展为燃烧电路,对小孔局部增加高电压,使得堆积在小孔周围的蛋白质等杂质变质和灼烧,然后用清洗液冲洗干净。 

(2) 自动报警功能:仪器可在开机或运行期间对仪器本身的温度、压力、液流系统、试剂、电子系统、光路系统等各个需要控制的部件进行监控,一但超过标准或出现故障,仪器可以显示这个故障和记录这个故障,并在手册或软件中增加排除故障的方法介绍。 

(3)远程诊断系统:更加先进的设备可以通过Internet 网络和仪器生产厂家在网络上建立联系,可以将你的故障和问题直接传送到仪器厂家的技术支持部门,由他们在网上对仪器进行诊断,提供解决方案,甚至工程师可以通过网络遥控的方式直接排除故障。 

(4) 帮助方式:许多仪器设计了很多故障自动诊断和帮助方式。早期的仪器一般是将仪器可能出现的各种故障和解决方法用用户手册的方式提供,目前更先进的方法是仪器可自动提供诊断报警,用符号表达或用文字直接表达, 或按帮助键(help) 后自动列出并提供解决故障的参考方法。而BAYER ADVIA 120 型血液分析仪更将整个操作说明和故障诊断等各项帮助程序存入系统中,可以方便的使用检索方式或链接方式找到各项目的说明和帮助,甚至提供动画方式对原理和仪器维护进行演示,提供各种散点图的模式和介绍。 

9、质控程序的进展:血液分析仪需要进行日常质量控制,以监控其测定结果的准确性。早期的血液分析仪一般没有质控程序,是依靠人工记录质控数据,人工绘制质控图。90年代以来由于微机技术的发展,使得包括质控程序在内的许多功能得以在血细胞分析仪上实现。例如浮动均值质控法,自动将符合条件的每20个样本的MCV 、MCH、 MCHC 数值求出均值并储存,最后绘制为浮动均值质控图,如Sebia 的Hemalyser 3 型就有这个功能。近年来的许多仪器都增加了多种质控程序,例如ADVIA 120型血液分析仪和SYSMEX XE-2100 型血液分析仪, 可以将日常质控的多达20组的质控数据储存在机内,或传人相连的电脑处理,甚至通过网络直接发送到厂家的服务器,设备厂商可通过网络直接了解每台设备每天的质控情况,必要时对用户进行指导和对仪器进行校正和检修。 

10、仪器校正功能的进展:任何一台血细胞分析仪都需要校正。最早人们需要通过调整设定域值的轮盘, 找到域值曲线最为平坦的部位。随后改进为根据靶值和测定值人工计算出校正因子, 将校正因子输入仪器,也可以在现有的校正系数上增加或减少一定的百分比。现行的校正方法更为方便,可直接将靶值输入仪器,让仪器测定该校正品后自己计算出校正系数并保存,当然这种仪器也可以通过人工直接调整的方法进行校正。 

11、用户界面的改进:所谓用户界面就是仪器的使用方式、可操作的或可看见的显示界面和程序。最早的仪器几乎没有什么复杂功能,需要用机械按键的方式选择白细胞计数还是红细胞计数,没有打印和储存,在电子数码管内显示的结果需要手工记录下来, 例如Coulter ZF 型。后来有了接触式按键和小型液晶显示屏以及小荧光屏显示,使得仪器在功能上和使用程序上有了一定的改观,可以选择不同的程序来操作仪器的各种功能和存储打印结果,如Medonic CA570 和CA610,Swelab AC920 等。现在更有一些仪器采用了触摸屏控制方式,使得仪器操作界面更加人性化和更加方便,减少了面板表面的各种控制按键和附加的专用键盘,如日本光电的MEK-6108 和MEK-6318,Coulter 公司的ACT-DIFF 系列仪器,都使用了触摸式荧光屏控制技术。 

现行的仪器则使用了更加先进的操作系统化物用户界面,对仪器的整个操作可以在电脑上进行,或者直接采用WINDOWS 的操作系统。仪器的用户界面更加复杂,功能也更加完善,例如Bayer Advia 120 型。许多仪器甚至提供中文操作菜单,非常方便国内用户使用, 或连接中文操作系统支持的电脑软件例如SYMEX KX-21 、日本光电MEK-6318 型等。 

12.仪器的打印方式:早期的仪器没有打印机,需人工记录简单的测定结果。当仪器的参数越来越多时,仪器开始配备打印机。有内嵌式打印机、外接式卡片式打印机和卷纸式打印机、电脑联网打印等许多方式,并可以选择多种打印格式,可将预设的参考值和提示字符以及提示语言同时打印。许多仪器多设有标准的RS-232 接口,可将测定结果的数据传到计算机中进行处理和打印。有的仪器本身可依靠自带的硬盘存储大量的数据和图形,如江西TECOM 的TEK-2000,3000 型,更多的仪器采用了匹配的电脑系统来存储患者大量的数据和图形。 

13、嗜酸细胞、嗜碱细胞提示或计数功能的加入: 嗜酸细胞和嗜碱细胞提示功能是在白细胞三分类的基础上,应用软件对图形分析后得到的参数,它一般来讲只具有提示含义,例如嗜酸细胞可能高于参考值等。这类仪器的代表产品有Coulter JT-IR 型。而能够对嗜酸细胞进行计数的Swelab AC920EO 系列则采用特殊试剂将嗜酸细胞保护起来,单独进行嗜酸细胞计数,这种方法应该是较早实现仪器对嗜酸细胞直接计数的方法之一,比提示性结果更加可靠。当五分类血液分析仪进入实验室, 单独具有嗜酸细胞计数功能的仪器才无开发的必要和市场需求。 

14、其他技术的应用: 多数现行的血细胞分析仪都有标准计算机接口,可与医院信息管理系统进行连接;使用软盘或大硬盘对数据和细胞分析图形进行储存和检索;使用条码技术对标本进行分类和处理;使用全自动进样装置实现全自动化;通过磁卡或条码技术对试剂进行管理;对血细胞分析项目进行有规律的组合和选择等。这些技术的应用给当代血细胞分析仪提供了更加方便的使用方式和良好的管理方式。现代的许多仪器还增加了包括对试剂的管理,试剂消耗、试剂有效期和温度的管理。 

15、红细胞分析技术:现行的血细胞分析仪一般可对白细胞进行分群或分类,但是对红细胞的体积大小和每个红细胞内血红蛋白含量的多少进行分析和分群则是更加特殊的技术。早在上世纪80 年代开始Technicon 公司采用激光分析技术制作的血液分析仪就可以做到这些,目前BAYER ADVIA 120 也是唯一可对红细胞的体积和色素含量进行分析的仪器。在测定过程中,仪器的高角度散射光可对每个红细胞内的血红蛋白含量进行测定,低角度散射光可对每个红细胞的体积大小进行测定,通过这两个参数组成的矩阵,可以得到红细胞的九分图,并可进一步得到每个分布区域内红细胞的数量和百分比。红细胞九分图能够更好的表达患者红细胞的体积和色素分布情况,对贫血的诊断和治疗有很大帮助。值得一 提的还有使用UFC 板技术的BAYER ADVIA 120 血液分析仪。该板采用集成的液流系统,将多种管道、电磁阀、反应池、电极等全部集成在一个塑料板内,形成仪器的心脏部件,所有试剂、标本、混合、反应都在板中进行,省去了大量管道和体积大的电磁阀和反应杯,所以样本流动和稀释过程都可从透明板中看到,是所有血液分析仪中唯一独创的技术。该集成液流反应板被称为UFC 板,主要在ADVIA 120 和2120 仪器上应用。 

15、应用其他原理的血细胞分析仪:除了我们常见的电阻式血细胞分析仪以外,还有某些特殊原理的仪器简要介绍如下。 

(1)激光法:应用单束激光照射到经过壳流技术处理的排列成一列的单个细胞上,根据细胞阻断激光束的频率以及PMT 收集到的激光折射信号,对细胞的数量、体积进行分析的仪器,以Sebia Hemalyser 3 为代表。目前采用激光法的高档血细胞分析仪开始逐渐升温,许多采用电阻法进行血细胞计数分析的仪器同时也添加了激光分析技术,如著名的VCS 技术就是典型代表。它除了可用于细胞计数外,还适用于对白细胞的分类、红细胞分析、血小板分析和网织红细胞分析等。 

(2)离心式血液分析仪:将血液充入到含义特殊试剂的毛细管内,在专用离心机上离心,根据血细胞中各种成份的比重不同而分布在不同的细胞层内的原理,血细胞被吖啶橙染色,各细胞层会有明显的颜色差异,然后将毛细管放在特殊的判读机上对不同的细胞层进行定 量分析,可得到红细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、血小板、血红蛋白等的参数。该仪器适合于携带, 并且不需要液体试剂,非常方便于外出使用, 适合于仅需要对红白细胞、血小板、血红蛋白以及中性粒细胞和淋巴细胞计数等常用参数的分析,这种仪器有B-D 公司生产的QBC 型。

(3)移动光学法:早期的光学法血细胞计数仪器, 采用普通光源,血细胞在移动过程中被检测到,不能分析细胞的大小和内部结结构,因此仅可进行红细胞和白细胞的计数,本文在开始部分就做了简易介绍的英国EEL 就是典型代表,现在已经停产。 

三、 白细胞分类技术的进展 

最早进行白细胞分类的设备仅根据白细胞的体积分布情况将淋巴细胞单独划分出来。在1970 年起Coulter 公司开始设计对白细胞进行分类的仪器,并首先推出了两分类的S-PLUS 系列仪器,然后在1980年又推出了T系列 ,都是可进行白细胞两分类的仪器,大家比较熟悉并仍在使用的Sysmex F800 和F820 型也是根据白细胞体积分布直方图进行粗略两分群的仪器。目前半自动或全自动型具有18参数含白细胞三分类的血细胞分析仪已经成为我国医院检验科的主流血细胞分析仪。 

仅仅根据简单的体积分析法就将血细胞进行分类,无论是三分类(3-part differential) 还是两分类(2-part differential), 其实是将细胞按照体积大大小进行了简单的分群处理,实际上是不科学的,因此国内专家和学者建议将此分类统一称呼为分群(group),即两分群型或三分群型血细胞分析仪。 

1、白细胞三分群法原理 

各种单纯电阻法血细胞分析仪的白细胞三分群法原理是根据白细胞体积分布直 方图进行分析和计算得到的。经过特殊溶血剂处理的白细胞,可将特定的细胞群进行处理,使得绝大多数淋巴细胞体积缩小,使得中性粒细胞体积适当增大。因此在白细胞分布直方图上出现两个明显的细胞分布峰。左侧体积较小的一群细胞称为淋巴细胞群(LYM),右侧体积较大的称为粒细胞群(GRAN),位于两者之间的称为中间细胞群(MID), 中间细胞群一般指含有嗜酸粒细胞,嗜碱粒细胞和单核细胞的细胞群。 

 Coulter 公司的三分群式仪器用于进行白细胞分群的处理器被称为通道处理器(channelyzer). 进行白细胞和红细胞分析的通道可达256个。每个通道表达一定的体积范围。它将体积处于35~90fl 之间的细胞划分为淋巴细胞群;体积处于90~160fl 的划分为中间细胞或单核细胞群; 体积160~450fl 的称为粒细胞群。例如Coulter JT-IR 及S-Plus系列。各厂家因所设计的仪器和配套试剂的不同,所设定的各群细胞的体积范围不尽相同,但采用的方法和计算方法是相近的。三分群法的白细胞百分比与白细胞总数进行计算可以得到各类细胞的绝对值。 

此外应用激光技术进行血细胞测定的仪器,通过激光照射每个流过FLOCELL 的细胞,在特点的角度安排散射光接收器,根据接受到的散射光信号的强弱来判断细胞体积的大小,同样能够产生具有明显三个分布峰的白细胞分布直方图,同样可以进行白细胞三分群的测定,代表性的仪器有Sebia Hemalyser 3 。 

2、白细胞五分类法原理 

进入90年代中期以来,国外许多厂家已经不满足于三分类型的血细胞分析仪,逐步开始研制和推出具有五分类或更多项白细胞分析技术的全自动型血液分析仪器,比较著名的厂家有:Coulter 、Sysmex 、ABBOTT 、Bayer 、ABX等。各厂家使用的白细胞分类技术多样化, 复杂化,使得白细胞分类技术更加成熟和可靠。而技术的提高也带来了仪器和消耗品(试剂)价格的增加。进入2000年以来,国内许多医院已经把购买血细胞分析仪的目光瞄向了此类仪器。 

(1) 采用VCS技术进行五分类的仪器: 这种技术集合三种测定方法于一体,同时对一个细胞进行多参数分析的方法,是Coulter 公司推出的专有方法。其中V代表体积测量,也就是传统的电阻法原理,可将体积大小差异显著的淋巴细胞和粒细胞分开;S代表高频电导性,该技术可直接测量细胞内部结构间的差异,了解细胞内部核浆比例和细胞内化学成分,可辨别细胞体积相同而内部性质不同的细胞,可将体积相近的淋巴细胞和嗜碱性细胞区分开, 因为他们的核质比例明显不同。S代表激光散射, 它可穿透细胞,探测细胞内核分叶状况和颗粒情况,通过分析光散射信息对细胞内颗粒性进行分析,细胞内颗粒粗的光反射强,因此可以用于单核细胞和三种粒细胞的区分。通过综合处理三个参数的特性,可全面对白细胞的各种特征进行综合评价分析,得到五项白细胞分类结果。应用VCS技术的血液细胞分析仪主要有MAXM 、STKS、HMX 等型号。 

(2) 采用采用阻抗、激光散射和荧光染色技术进行五分类的仪器:这种技术主要应用在Sysmex 研制和开发的SF-3000 、SE-9000 、SE-9500 、XE-2100 、XT-1800 等系列血液分析仪中。直流电阻抗法(DC)用于测量细胞体积大小。激光散射产生的前向散射光、侧向散射光和侧向荧光可用于探测测白细胞体积大小、细胞内含物的情况 ( 细胞核以及颗粒情况),侧向荧光则可以反应细胞内托样核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA )的含量,特有的嗜酸性粒细胞检测溶血剂Strmatolyzer-EO 可将除了嗜酸细胞以外的所有细胞溶解或萎缩,含有完整嗜酸细胞的液体通过小孔可以按照电阻法计数技术进行计数。在嗜碱细胞通道中,使用特殊溶血剂Strmatolyzer-BA 可将除了嗜碱细胞以外的所有细胞溶解或萎缩,含有完整嗜碱细胞的液体通过小孔可以按照电阻法计数技术进行计数。幼稚细胞检查通道(IMI) 可以根据幼稚细胞膜比成熟细胞膜表面含有脂质较少的现象,在细胞稀释悬液中加入硫化氨基酸,由于占位不同,结合在幼稚细胞表面的氨基酸较多,对溶血剂有抵抗作用,当加入溶血剂后成熟细胞易被溶解,而幼稚细胞不易被破坏,可通过电阻法检测出来。综合各个测量方法,得到白细胞五分类的图形和数据。 

(3)激光散射和细胞化学染色技术:采用这项技术的为Technicon H1 、H2、H3 型,该类型仪器的最新型号为Bayer 公司的Advia120型和新近推出的Advia 2120 型。 

仪器在白细胞分类上采用了白细胞过氧化酶测定通道和嗜碱粒细胞测定通道。根据细胞化学染色的特性进行白细胞分类。各类白细胞对过氧化物酶的反应是这样的:早期的原始粒细胞为阴性,原始粒细胞以下各阶段都含有过氧化物酶,并随着细胞的成熟而增强。不同的粒细胞过氧化物酶含量不同,嗜酸性粒细胞具有最强的过氧化物酶,中性粒细胞含有较强的过氧化物酶,嗜碱粒细胞不含此酶。单核细胞除早期原始阶段外,均含有较弱的过氧化物酶。淋巴细胞不含过氧化物酶。根据激光法散射光强度进行的细胞体积的测量同时也获得了细胞大小的信息,在白细胞过氧化物酶散点图上,X 轴表现过氧化物酶强度,过氧化物酶强阳性细胞位于右端;Y 轴表现散射光强度信号,位于上方的表示散射光信号强,细胞体积大。除了嗜碱细胞外每个类型的细胞根据它们的特点被记录于特定的位置,在设定的门的范围内形成分类。嗜碱细胞则是通过嗜碱细胞和分叶核通道测定的,因淋巴细胞与嗜碱粒细胞都无过氧化物酶,因此需要通过嗜碱细胞通道,特殊嗜碱细胞试剂可将除嗜碱细胞以外的其他白细胞膜破坏,胞浆溢出,仅剩裸核。被激光照射后仍然保持正常体积的嗜碱细胞位于Y 轴上方,体积小的其他裸核白细胞分布在下方。 

(4)多角度偏振光散射法应用于白细胞五分类(MAPSS 技术): 该技术的基本原理是标本在水动力聚焦系统的作用下进入检测部,在激光束的照射下,细胞在多个角度都产生散射光。仪器特别设置了四个角度来收集散射光的信号。0 度为前角光散射, 用于粗略判断细胞体积大小;10 度为狭角散射, 用于检测细胞结构及其内部复杂性的指标;90 度为垂直光散射,用于对细胞内部颗粒及细胞核分叶情况的分析;90 度偏振光散射,基于颗粒可以将垂直角度的激光消偏振的特性,将嗜酸性细胞从中性粒细胞和其他细胞中分离出来。根据散射光的角度和位置,仪器内部的四个检测器可以接收到相应的信号,由仪器内部的微处理器进行分析处理,不同的细胞将被安置在散点图上的相应位置,根据计算将结果白细胞分类结果得到。开发和采用这种技术的为ABBOTT 公司生产的CD-3200,CD-3500,CD3700,CD4000 等型号。

(5)采用图像分析的单纯细胞分类仪,以80 年代日本日立公司生产的-8200 为代表。该仪器完全采用图像分析法,将血片染色,用含有扫描镜头的显微镜扫描每个视野,将获取的细胞图像与仪器内存储的标准图像进行对照分析,判断该细胞的类型。此类仪器需要大型的计算机系统支持,由于在当时电子计算机图形识别和分析技术还不很发达,因此该类设备发展收到一定程度的限制,分析速度慢,在细胞判断的准确性上也不尽人意,没有流行起来。现代的计算机图形图像分析技术,由于电子计算机运算速度的飞速发展,已经有了很大的进步,如果能继续开发此类设备,因为其具有非常直观性,与人对细胞的判断分析方法非常接近,想必会大有前途。 

四、血细胞分析仪的发展近况和展望 

近年来由于电子计算机技术的飞速发展,在血液分析仪上也不断采用了最新的电子、光学、化学技术,由于临床工作对于血液细胞分析内容的要求的增加,提供更加方便、更加适用、更多功能、更加准确、更快速度和更多参数的血液分析仪,已经是各血液分析仪生产厂商的目标。 

1、血常规检验多参数化:近年来许多仪器都在增加新的参数以满足临床在诊断和鉴别诊断方面的需求。最早加入到并得到公认的参数是红细胞体积分布宽度(RDW), 目前该参数已经成为许多型号血细胞分析仪的标准参数,在各种贫血的诊断和治疗中起着重要作用,而该参数是很难应用人工方法测定的。随后有关平均血小板体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)、血小板压积(PCT)、大血小板比率、血红蛋白浓度分布宽度、异常淋巴细胞提示、幼稚细胞提示等各种参数和功能也不断的添加到一些品牌的仪器上,目前有的仪器甚至可以提供40~50 种测量或计算参数。但很多的新参数目前仍不能应用于临床,仅限定在实验室中,或供研究使用。 

2、多功能合成扩展:血细胞分析仪已经不仅仅局限在进行常规血细胞分析,它增加了许多扩展的功能。例如将网织红细胞的计数和分析功能加入其中,例如BAYER ADVIA 120;SYSMEX SE-9000/SE-9500/XE-2100;COULTER MAXM/STKS/HMX 型;ABBOTT CELL-DYN3200/3500R/4000;ABX 120 等。一些仪器另外增加了幼稚细胞分析和有核红细胞分析功能,例如SYSMEX SF-3000/SE-9000/SE-9500/XE-2 100;BAYER ADVIA 120;ABBOTT CELL-DYN/3500/4000 等。更有一些仪器把流式细胞分析仪的某些简单功能进行了合并,这样在常规血液分析仪上就可以得到某些淋巴细胞亚群的分析结果,例如在 COULTER STKS 上可以同时测定CD4 和CD8 ,在ABBOTT CELL-DYN4000 上可以测定CD3、CD4、CD8 和CD61, 使得一机两用。此外BAYER 最新发布的ADVIA 2120 型血液细胞分析仪又将脑脊液的细胞分析功能加入进来,使用特殊的试剂和程序,可对脑脊液中的红细胞,白细胞和分类进行测定。 

3、检测速度的提高:许多仪器由于增加了自得进样系统,使得测定速度加快,已经不满足于每小时检测60 个标本的需求,一般可以达到每小时80~100 个样品,在不包含网织细胞检测的情况下,BAYER ADVIA 120 可以达到每小时120 个标本;而SYSMEX KX-2100 可以达到每小时150 个标本。这些仪器都可以在自动成批进样的同时,随时插入急诊检验的标本。 

4、方法的改进和进展: 为了达到更加准确的计数和分析结果,血细胞测定和分析的方法已经不局限于某一种单一的方法,如单一的电阻抗法或激光散射法,而是互相结合,在前面的文章中以有介绍。除了在白细胞分类上采用多种处理方法外,在红细胞和血小板分析上也采用了光学和电阻法结合的处理方法,以期得到更正确的结果;对红细胞体积进行三维空间分析(3D),对红细胞进行体积大小和色素含量的分析;对血红蛋白测定不仅使用比色法,同时还使用激光散射法进行单个红细胞血红蛋白量的分析,以尽量减少高WBC、乳糜血、高胆红素等对血红蛋白比色的影响等技术的应用。由于方法的改进,这些仪器已经不仅仅采用2~3 种试剂来完成测定工作,常常是6 种以上的试剂联合使用,才能够适应这些方法, 例如Bayer Advia 120 型需要多达11 种试剂,而这些试剂由于技术含量较高,因此还没有替代产品。 

5、应用的方便性: 对于操作这来说,仪器最大的优越性还应该体现在操作的方便行和自由性上。许多厂家都考虑到了这一点。例如可以使用静脉血液、也可以使用末稍血液;可以在标本量很大的情况下选择全自动进样系统,也可使用单独闭盖或开盖取样系统,要知道闭盖全自动进样或单独进样对操作者是非常安全的操作方式;或对项目可作适当的组合,以适应临床及患者的需求,例如操作者可以选择CBC 方式(仅计数、不分类)、CBD+DIFF 方式(计数加分类)、RET 方式(网织红细胞分析)、有核红细胞分析(NRBC)、幼稚细胞分析等项目,还可将它们任意单选或组合;条码的应用给标本编号提供了方便,仪器通过自动扫描条码,来鉴别标本的来源、需要检测的项目和区分患者,最后根据条码提供的信息将结果返回到临床或病人档案中,为检验数据的电子化提供了极大方便,也减少了编号带来的差错。上述的许多功能已经在许多新型的高端五分类式血液分析仪中得到实现。 

6、产品的系列化:各有实力的公司不断开发系列化产品以满足不同类型用户的需要。例如COULTER 公司早期的S 系列、T 系列, 近期的AC·T 系列仪器,有最简单的AC·T 8 型只有8 个参数到12 参数,到含有18 参数三分类的AC·T DIFF ,到具有5 分类的AC·T 5-DIFF ,甚至还有可增加动物血液分析的型号。日本SYSMEX 、美国ABBOTT 、日本光电MEK 以及ABX 都有各种系列化仪器不断推出,以满足各种用户的不同需求。

7、流水线化:在全自动血液分析仪器的基础上实现全自动流水线化,是血液分析的又一大飞跃,但这需要雄厚的资金支持。SYSMEX 的HST 小型血液分析流水线将电脑控制终端、SE-9000 血细胞分析仪、R-300 网织细胞分析仪、SP-100 血片涂片机结和在一起,使血液标本从计数开始自动按程序运行到推片和染色结束,全部自动进行(图37)。近年来ABBOTT (图38)、COULTER 、SYSMEX 等许多血液分析仪制造厂商都有类似小型血细胞分析流水线系统推出。 

笔者曾经在日本一所著名的大学医院参观,该实验室的自动化流水线大的惊人,从病人抽血取样开始,由实验室前处理设备自动对血标本进行分检,自动离心,然后在充满整个实验室的连通轨道上进行传送,血标本根据条码上的各种信息走到相应的设备上自动取样和测定,测定后的标本(包括血液、凝血、生化、免疫各种实验)自动盖好盖子,自动进入大型冰箱内储存。而各种仪器测定的结果经过网络传入终端设备,由实验室医生核定签发后,经过医院网络进入医生诊室和电子病历。整个实验室只有20 余个工作人员,而在前台抽血或接收标本一般工作人员,与在后台签发报告和进行形态学检查的工作人员占了很大比例,真正在操作机器的技师则很少。实验室前处理设备和连接轨道以及电脑控制系统是实现实验室全自动化的关键,目前我国还没有那家医院有能力或资金支持建立这样的全自动流水线实验室操作系统。 

7、其他范围应用的专用仪器: 某些可同时用于人血细胞和动物血细胞计数的血液分析仪也在一定范围内得到应用;在颗粒计数和分析基础上开发的微粒粒度计,可应用于输液液体内的颗粒计数、空气中颗粒物质的计数以及其他微小颗粒的计数;专门用于精子计数的仪器也属于细胞计数这个范围。 

8、国产血细胞计数仪发展情况:我国早在60年代就开始进行血细胞计数仪的研制工作,1965年上海生产了我国的第一代血球计数仪(图39),70年代北京也有简单的模仿国外品牌的血球计数仪生产,笔者手头就有上海XF503 型、北京生化仪器 厂的仿COULTER ZF 型、南京XF-1 型(图40)、济南DXJ-1 型等一些厂家早期生产的血球计数仪资料,从资料介绍和照片看都属于仅能计数红细胞和白细胞的仪器。随着改革开放的开始,国内一些厂家于国外合作生产了第二代的血液细胞分析仪,其中最著名的也是应用最为广泛的当属ERMA PC-603 和PC-604 型,当时在国内许多大医院担当主要的血球计数任务,该仪器操作 简便,稀释剂开放。仪器的主要参数有红细胞、白细胞和血红蛋白三个参数,而PC-604 型在主机的上方增加了特别的计算器,因此可以得到MCV、HCT 、MCH 、MCHC,并能够打印结果( 图41), 此外还有专用于血小板计数的PC-601 型血小板计数仪。 

从此以后,由于国外各种带白细胞两分类和三分类,带自动稀释的仪器大量进入中国市场,大大冲击了国产血球计数仪的地位,同时也由于技术的缺乏和资金的缺乏,国内生产的血球计数仪没有得到进一步的发展, 开发、研制、设计和生产血液分析仪的能力逐渐下降、人员流失,处于停滞状态。进两三年来,国内的某些高新技术行业投资进行第三代,也就是具有18项参数含白细胞三分群功能的血细胞计数仪。目前市场上见到的有南昌特康公司生产的TEK-2000 和TEK-3000 型(图42),有它采用自动稀释技术、可使用全血和末梢血,全中文化WINDOWS 操作界面、中文病人资料管理和中文打印报告,大型液晶显示屏,具有质控程序和数万个数据储存功能,自动清洗和排除堵孔等功能,是国内开发比较早的三分群式血细胞分析仪。其他如桂林百利特3100 、南昌百特HL-2400 等型号和的三分群式血球计数仪生产和销售。此外国内厂家也在开始设计和研发五分类式血液分析仪器。期望我国的科技人员和实验室工作人员能有更好的配合,能向家电业和电脑业一样,与国际水准接近,生产出具有先进水平的、现代化的血液细胞分析仪器。 

结束语: 

本文介绍了血细胞分析仪自发明以来半个世纪的进展情况,介绍了最新的血液细胞分析技术和方法。对于业内从事血液细胞分析工作的同行来说,大家可能更关心它的最新进展。由于资料繁多,且不可能在有限的篇幅内对各厂家和各类型的血细胞分析仪进行详细介绍,希望读者原谅并尽可能与仪器生产厂家取得联系。文中有不实及谬误之处请读者批评指正。 

目前血细胞分析仪越来越普遍的应用于各级医院的常规作中,但是并不是说所有的结果都是准确无误的,目前在血细胞形态学方面,无论是五分类还是更多的分类,甚至是具有专门幼稚细胞分析通道的仪器,仍然不能根本解决血液细胞形态学的问题,仍然不能完全以仪器分类结果彻底取代人工分类。此外仪器一些固有的产生误差的因素还没有彻底解决,某些影响仪器计数准确性的个别因素还存在,或某些仪器具有设计上的缺陷和应用上的局限性,因此无论是细胞计数还是多种参数的分析结果仍然会有问题发生。不要总是相信仪器,要认真对待每个实验样品和结果,分析判断这个结果,检验工作者要对仪器的性能,质量控制,局限性,常出现的故障,特别对三分群的直方图和五分类的散点图有深刻的了解,善于发现问题和解决问题。这一切都有待于通过人们在熟练掌握仪器的性能和不断提高的自己的知识水平上,通过扎实的的显微镜下对血细胞形态学认知的基本功来解决问题。 

*原文作者:北京协和医院检验科 副主任检验技师


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