服务
中心
登录
收藏
联系

  • 官方微博

  • 微信订阅

  • 兴趣部落
通知
分享
建议
顶部
收起

干细胞实验技术入门

发布时间:2015-03-31作者:器械科



  《Science》刚刚公布的十大科学突破中,占据首位就是细胞重新编程技术(iPS,induced pluripotent stem cells),这一才初初“面世”一年的干细胞技术引发了生命科学研究领域的极大震动,引用《科学》杂志负责新闻的副主编Robert Coontz的话就是“这项研究几乎在一夜之间开启了一个生物学的新的领域,它有希望成就医学上挽救生命的进展。”

 

       由于这一技术的迅速发展,涌现了许多“干细胞技术新手”,但是对于如何培养这些细胞,以及诱导细胞分化,初接触这一技术的研究人员常常感到束手无策,即使花了很多时间还是抓不准这些细胞的特性,无论是研究人类胚胎干细胞hESCs,还是人类iPS细胞hiPSCs,都需要花费大量的时间重复铺板,来保证这些细胞自然分化。

 

        来自萨克生物研究学院(the Salk Institute for Biological Studies)干细胞中心的主任Travis Berggren建议,对于新接触干细胞研究的实验人员来说,在收到第一批冷冻细胞的时候,要抛开所有之前有关哺乳动物细胞培养的概念,因为许多标准细胞培养的技巧方法也许并不适用于干细胞,而且由于多能性有关的细胞机制至今了解的并不多,因此要想知道在未分化状态,哪些培养物和材料能最好的诱导细胞,甚至进行特征描述,这些都可能非常困难。除此之外,要确保培养物不被细菌感染,注意要不断的对加入的试剂进行检测。

 

1.了解细胞

 

      来自加拿大多伦多大学的Peter Zandstra实验室的一项研究项目就是:通过从单层细胞悬浮液中收集人类胚胎干细胞hESCs,提高hESC分化的一致性和产量。

 

       人类胚胎干细胞hESCs和人类诱导多功能干细胞hiPSCs的分化需要细胞聚集,但是细胞团中的细胞常常大小和形状不一,从而导致不同步分化。为了能解决一致性的问题,Zandstra实验室的博士后Mark Ungrin尝试利用一些公开的实验指导手册获取单细胞悬浮液聚集体,刚开始的时候,他能得到稳定的聚集细胞,但是之后这些细胞就纷纷死了,他回忆道,“不同实验中细胞的大小都不一致,有时我在一个孔里能发现几种聚集细胞。”

 

      Ungrin花了6个月的时间钻研细胞培养基,之后,他开始转向细胞本身,结果发现了两个重要的因素:一个是他惊讶的发现,经过几代传代的成熟的hESCs一般都会形成稳定的细胞聚集,而在分化前阶段的细胞则倾向于形成单细胞悬浮,因此Ungrin决定在细胞分化之前收集细胞。另外一个发现就是一种Rho关联的激酶,这种小分子抑制剂在之前的研究中发现能提高细胞存活率,Ungrin发现对于他的干细胞,这种小分子也起作用。

 

        Ungrin表示,“进行人类胚胎干细胞研究最令人头疼的事之一,就是你在实验室中做的工作很难重复,而你又不知道是什么原因”,即使是用不同的移液器进行平板转移,也有可能造成不同的结果。因此Ungrin建议研究人员除了记住培养基,还要记住自己细胞的年龄阶段和状态,这些都会影响存活率。

 

        干细胞培养确实是颇令人烦恼的一项实验过程,这是许多刚进行干细胞研究的实验人员所没有意料到的,不过通过越来越多积累的实战经验也许能渐渐悟出其中的前因后果,不过也可以利用一些商品化的产品帮助我们尽快的解决这些问题。

 

        针对干细胞培养,著名的细胞培养产品公司HyClone(属于Thermo Scientific)推出了AdvanceSTEM系列产品,这一系列产品主要支持小鼠干细胞研究的各种应用,包括细胞扩增,保持小鼠胚胎干细胞和人成体间质干细胞的未分化状态,将间质干细胞专一的分化成神经元,脂肪细胞,软骨细胞和骨细胞等类型的细胞等等。

 

        其中AdvanceSTEM?推荐的DMEM是一款低渗DMEM,这款产品具备一般常规细胞培养的影响因素(生长因子等),重要的是具有与小鼠胚胎干细胞相近的最佳渗透压,而且其特异的配方保证在37℃5%CO2的培养条件下能够保持生理状态下的pH,这些对干细胞生长和保持一致性非常有好处,另外可以在这个DMEM中加入AdvanceSTEM?血清替代物,帮助使胚胎干细胞保持在未分化的状态,AdvanceSTEM?血清替代物是一种无血清培养物,血清是动物细胞离体培养常见的培养液,在某些情况下不能用血清培养细胞,比如观察一种生长因子对某种细胞的作用。

 

        另外Invitrogen公司在今年5月就推出了首个间充质干细胞的无血清培养基,专门用于间充质干细胞(MSC)或来源于骨髓的干细胞的培养。STEMPRO MSC SFM是完全限定的,意味着培养基中的每一种成分都是已知量的,因而排除了显著的批间差。这个培养基能使MSC维持未分化状态超过9代,而用传统的加血清培养基培养的细胞在5代后就开始出现分化。此外,Invitrogen还推出了一种完全限定的无动物来源的干细胞基质,用于胚胎、间充质和神经干细胞的附着和扩增。(其中STEMPRO MSC SFM入围了本年度十大创新产品评比的候选名单,欢迎大家投票)

 

2.寻找标记

 

        来自维吉尼亚共和国大学在干细胞生物工程学家Raj Rao希望能利用细胞表面标记物了解人类胚胎干细胞,进而调控胚胎干细胞,但是目前对于评估hESCs的多能性,以及胚胎干细胞在分化的时候会产生什么样的变化,并没有设定标准。通常采用的细胞标记包括阶段特异性胚胎抗原3和抗原4(SSEA-3和SSEA-4),但是不同的细胞系在SSEA-3和SSEA-4的表达上差别较大,很难统一。

 

        为了解决这个问题,Rao利用了一种在胚胎发育过程中结合和修饰细胞表面糖组分的蛋白:凝集素lection。小鼠ESC有关的文献表明,在发育的植入前和植入阶段,凝集素受体会展示在细胞表面。Rao研究小组对14种不同的凝集素进行了分析,希望能找到与SSEA-4同时表达的凝集素,结果他们发现了一些这种蛋白,比如蓖麻凝聚素(Ricinus communis agglutinin),怀槐凝集素(Maackia amurensis),这些蛋白可以紧紧的结合在hESCs上,能用于预测多能性。

 

        Rao表示,你实验的标记越多,那么就越能证明细胞的多能性。对于希望进行凝集素检测实验的研究人员而言,这种方法相对直接和便宜,需要的只是一些抗体,和一台台式的流式细胞仪。

 

        但是要记住,对于不同的细胞系,甚至是同一细胞系的不同细胞群,凝集素和其它细胞表面标记物,比如SSEA-4的表达都是不相同的,要想增加结果的可信度,可行的一个办法就是增加分析样品的数目。

 

         其中Rao提到的这两种抗体,默克,Invitrogen等厂家可以提供,至于台式流式细胞仪,可以考虑下占市场较大份额的公司:美国的BD(Becton Dickinson)公司和贝克曼Beckman Coulter公司(原名称Couter)。

 

         BD的流式细胞仪,不消说,是经典中的经典,其生产的产品都冠以FACs(fluorescence-activated cell sorter)荧光激活细胞分选仪的名称——FACs即流式细胞仪的缩写,这不仅说明了BD生产流式细胞仪的时间早,也说明了其流式细胞仪的品质高,近期国内进行的重组杆状病毒的研究就是利用的他家的流式细胞仪。BD的流式细胞仪产品型号比较齐全,包括FACSCount(小型流式细胞仪)、FACSCAlibur(流式细胞仪)、FACSAria(流式细胞分选仪)、FACSVantage SE(多色分析和高速分选流式细胞仪)、LSRII(数字化分析型流式细胞仪)。这些流式细胞仪各有各的特点,比如FACSAria流式细胞分选仪这种台式高速细胞分选仪的出现大大提高了分选性能,同时还增强了其它功能(具体可见2008技术点评:流式细胞分选)。

 

        近期BD还推出了首款干细胞分选试剂盒,这种即用型的多能干细胞鉴定和分选试剂盒包括了预滴定的荧光标记抗体,实验设定磁珠、验证过的实验步骤以及软件分析模板。此试剂盒针对现有的BD流式细胞仪优化过,开箱即用。即使经验不多的流式细胞仪用户,也能快速掌握这种方法。它同时将分析与分析之间的变异性减至最低,让结果更快更可靠。在抗体用完之后,能轻松补充抗体,满足特别的研究需求。

 

        另外Beckman Coulter推出的适合筛选量大的实验室的流式细胞仪,可以用于生物医学基础研究以及临床检测的许多领域,如遗传、肿瘤、血液、免疫等诸多研究中红细胞、T细胞、淋巴细胞亚群测定、检测早期细胞凋亡、肿瘤细胞免疫测定等。

 

       除了这两个大品牌,也可以考虑其它流式细胞仪,比如Accuri Cytometers、Guava科技公司、Union Biometrica、Amnis等,近期Guava科技公司与Millipore公司宣布将会奖励给一名科学家一台Guava的流式细胞仪,价值10万美元,条件是这名科学家的创新研究计划将会推动对细胞生物学的了解。申请时间为2009年的1月1日到4月30日,在Millipore和Guava的网站上都可提交有兴趣的国内科学家可以试一下。

 

3.防止污染

 

        萨克生物研究学院(the Salk Institute for Biological Studies)的Travis Berggren研究小组通过成纤维细胞饲养层研究hESC自我更新调控。但是05年Berggren在WiCell研究院进行研究的时候,许多实验室的细胞被支原体污染,这种污染物具有抵抗抗生素的能力,并且不容易观察到。

 

        研究小组花了两个星期的时间清洗细胞和培养物,灭菌消毒,但是他们浪费的不只是两个星期的工作时间,由于支原体生长很慢,并且不会干扰分化,因此研究人员长达一个月的时间都不知道所研究的细胞已经被污染,即使在发现了污染物后,一些合作研究人员即使检测到了污染,仍然认为他们的细胞能存活,Berggren说,“这告诉我们,实际上早就应该进行检测了。”

 

        因此Berggren的研究小组建立了一个常规检测过程,在其后的三年里他们都严格执行着这一步骤,每个星期他们都会通过支原体特异性酶或DNA检查新培养物,每2-4个星期检查旧培养物。所有新的培养物质,比如用在饲养层的小鼠成纤维细胞,都会先经过检查,并且在使用培养物之前,他们都会至少验证两次。

 

        对于将小鼠ESCs的研究转向人类ESCs研究的实验室而言,支原体特别的麻烦,这是因为人类干细胞在操作上更难,它们更易失去分化潜力,或者死亡。进行hiPSCs研究的实验室也需要注意这个污染问题。

 

        对于这种情况首先需要的是预防,确保细胞来源和培养物没有受到支原体的感染,再来就是需要及时的发现支原体感染,检测支原体的方法有很多,包括肉眼观测方法,PCR方法,荧光检测方法,电镜检测方法等,其中比较常见的是PCR方法和荧光检测方法,前者譬如Sigma-Aldrich,Stratagene等公司都有相关的试剂盒,后者用的比较多的是Hoechst公司的相关产品,具体可见支原体细胞培养中的大敌。

 

4.干细胞分化

 

       美国ATCC干细胞中心的华人科学家马武(Wu Ma,音译)研究组在细胞外基质ECM对于干细胞自我更新和分化十分关键的这一理论的基础上,希望能了解ECM中有哪些元素对于干细胞形成神经祖细胞具有决定作用。

 

       他们检测了两个不同的hESCs系,将这两个细胞系铺在五种不同的基质表面:多聚赖氨酸(poly-D-Lysine),纤维粘连蛋白(fibronectin),人层连蛋白(laminin),I型胶原蛋白(type 1 collagen),以及Matrigel(BD公司的一种ECM),结果他们发现laminin上培养的细胞是分化得最好的,研究人员也发现这种效果也与干细胞整合素受体有关,因为阻断a6b1受体会减缓分化。

 

       虽然马博士发现了最适合于他的基质,但是这并没有给出一个“包治百病”的“药方”:同一培养机制对于不同的细胞系具有不同的效果,因此马博士建议,在选择培养物和其它介质的时候,不仅要了解过去的干细胞研究的微环境如何,还要仔细看看正常体内发育过程中所涉及的细胞因子。比如说要分化成神经细胞,那么就可以看看哪些是大脑发育过程中常见的因子,不过也要注意这也是有局限性的,一些人类胚胎干细胞系在同样的培养条件下也会产生多少不一的神经细胞。

 

Tips:

 

1.参加培训

 

        由于干细胞实验操作相对而言还是一门比较新的学问,因此如果允许的话,可以考虑参加一些培训,比如在去年的美国国立卫生研究院NIH的预算中,有一项(T15)就是针对人类胚胎干细胞培养和维持进行培训,NIH的干细胞特别小组(Stem Cell Task Force)仍然在讨论这个项目。国内的也有类似的培养班,比如中科院生化所的人类诱导的多能干细胞(iPS细胞)技术高级培训班等。另外一个方法就是寻找一些机会和在这方面操作熟练的人学习,或者进入其它实验室进行学习和实际操作。

 

2.首先检测对照

 

        来自Invitrogen公司的干细胞专家Mahendra Rao推荐两种便宜,又能来源方便的细胞系:BG01V和NT-2(N tera-2),前者是一种核型异常的ESC细胞系,后者是一种胚胎癌细胞系,这两种细胞系都可以从ATCC获得,利用这两种细胞可以检测培养物:如果选择的培养介质会导致这两种细胞死亡,那么实验的ES细胞也存活不了。

 

3.不要随意改变

 

一旦获得一个细胞系,就要按照指导严格的操作,不要随意改变培养条件,当保存了冷冻细胞株之后,才能根据实验需要改变培养条件。

 

4.仔细阅读

 

         如果你不是一个“熟手”,那么最好还是仔细研究下近期相关的研究成果,实验指导,和细胞的特性,一本值得推荐的书是Human Embryonic Stem Cell Protocols(Kursad Turksen)和Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide(Jeanne Loring)。

 

5.常规检测

 

早期要建立一些质量控制的常规检测,包括监测培养箱中的温度,湿度,二氧化碳水平等等,另外正如上面所述的,定时检测细胞是否被污染也十分的重要。


中国康复器具协会 | 中国医疗器械行业协会 | 中国医学装备协会 | 国家食品药品监督管理总局 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 |  中国医疗健康产业发展策略联盟 | 中华医学会