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免疫组化双染实验操作步骤

发布时间:2015-03-31作者:器械科



第一抗体的染色:

 

1、 将切片浸在3%H2O2甲醇溶液(新鲜配制)中10分钟,PBS冲洗2分钟×3次

2、 加100ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上,室温孵育10分钟,倒掉(不能冲洗)

3、 加入一抗(按照说明推荐浓度和孵育条件)

4、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS),冲洗2分钟×3次

5、 加入100ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2),室温孵育10分钟

6、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次

7、 加入100ul(2滴)链霉亲和素-AP(试剂3)的二抗,室温孵育10分钟

8、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次

9、 准备底物溶液:将1滴试剂4A和4B加入到1ml去离子水中,充分混匀;再加入1滴试剂4C,充分混匀

10、 加100ul(2滴)配好的AP底物溶液,室温孵育(镜下检测孵育时间)

11、 使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应

 

         

 

 

 第二抗体的染色:

 

12、 加100ul(2滴)双染增强剂(试剂7),孵育

13、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS),冲洗2分钟×3次

14、 加100ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上,室温孵育10分钟,倒掉(不能冲洗)

15、 加入稀释好的一抗(按照说明推荐浓度和孵育条件)

16、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS),冲洗2分钟×3次

17、 加入100ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2),室温孵育10分钟

18、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次

19、 加入100ul(2滴)链霉亲和素-HRP(试剂5)的二抗,室温孵育10分钟

20、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次

21、 准备底物溶液:将1滴试剂6A和6B加入到1ml去离子水中,充分混匀;再加入1滴试剂6C,充分混匀:

22、 加100ul(2滴)配好的HRP底物溶液,室温孵育(镜下检测孵育时间)

23、 使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应

24、 使用复染试剂染色(根据需要选择)

25、 封片剂(试剂8)封片,显微镜观察结果 免疫学免疫组织化学


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