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免疫组化SABC法操作步骤大全

发布时间:2015-03-31作者:器械科



免疫组化SABC法操作步骤大全


     

 

1、洗载玻片

       将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37 oC温箱中,将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys带正电,而大多数的组织带负电荷,从而产生吸附作用。

 

2、包埋组织

         先在铁模具中加入一些液态石蜡,先稍微冷却,然后再将待包埋的组织置于石蜡之中,并排列整齐,再将塑料模具盒盖上,最后加入少许液体石蜡,进行冷冻,使石蜡变成固态。

 

3、切片

        将包埋好的组织从模具上取下来,并置于石蜡切片机上,切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致,然后调节切片的厚度,一般为5 um,如果比较难切,则可以适当调整厚度,用毛笔将切割的载玻片向外拉,并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40 oC温水中。

 

4、捞组织

         当组织载玻片置于40 oC温水中之前,要先将水浴中的气泡赶走,以免气泡受热上浮而贴到组织上,组织受热展开,最好是组织不起皱纹,用载玻片捞组织时,一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张,其中2-3张是备用的,每张载玻片上通常捞两份组织,做对照使用,这样形成的误差就比较小了,而且捞载玻片的时候最好方向一致,以便观察,再将捞出来的载玻片置于架子上,放入37 oC温箱中烘干。

 

5、脱蜡

         依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理。一般在每个试剂中放10 min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15 min。

 

6、抗原修复

          脱蜡后在清水中冲洗一段时间,加入3%H2O2浸泡10 min,从而除去内源性的过氧化氢酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗两次,再加入柠檬酸缓冲液,放入微波炉中蒸煮3 min(中火),一般刚到沸腾即可,冷却至室温,然后再蒸煮一次,冷却至室温,蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。

 

7、血清封闭

         冷却至室温后,将柠檬酸缓冲液倒掉,水洗2次,并将载玻片置于PBS中5 min,洗2次,擦干组织周围的PBS液,马上加上血清,使一些非特异性的位点封闭起来,然后放入37 oC温箱中半小时。血清稀释10倍(900 ul PBS:100 ul血清封闭液)。


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