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凝胶迁移实验(EMSA)中的常见问答

发布时间:2015-03-30作者:器械科




凝胶迁移实验(EMSA)中的常见问答


在做凝胶迁移实验的时候,大家会遇到很多问题,这里列出了几点,希望能对大家的实验有所帮助。

 

1.  什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验?

 

凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技

术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和

特定的RNA序列的相互作用。

 

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝

胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA复合物或RNA复合物比非结合的探针移动得慢。同位素

标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合

蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合

蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结

合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或

RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特

异结合。

 


2.  实验中需要用到什么试剂?

 

凝胶迁移实验需要的结合蛋白,可来源于纯化或部分纯化的蛋白,或粗的核和胞质抽提液。还必须

制备同位素标记的DNA或RNA。一般,DNA核苷酸探针用32P和T4多核苷酸激酶来作末端标记,同位素

标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。Promega公司的Riboprobe/sup

系统(a,b)可用于同位素标记的RNA的体外合成,DNA 5'末端标记系统,用于制备DNA探针,结合

反应所需的组分有:含盐的溶液(氯化镁,氯化钠,或氯化钾)、缓冲体系(Tris-HCl或HEPES)、

还原剂(DTT)、甘油、非特异的竞争DNA(poly(dI:dC)dI:dC),也可能含非离子去污剂。在结

合蛋白和同位素标记的探针作用后,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物,随后将凝胶干燥并

放射自显影,或用PhosphorImage/sup分析。

 


3.  凝胶迁移实验系统提供了什么试剂?

 

Promega公司提供一种凝胶迁移实验系统检测DNA结合蛋白,系统可作为这类实验的一种阳性对照。

系统包括目的寡核苷酸,对照DNA结合蛋白,结合缓冲液,用于寡核苷酸探针末端标记所需的试剂。

Core 系统包括含重组AP2蛋白(AP2抽提液)的大肠杆菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液

是从表达AP2蛋白的大肠杆菌中提取的。另外,Core系统还含SP1同源寡核苷酸,凝胶迁移结合缓冲

液,和能作20次对照实验的HeLa核抽提液。Complete系统含另外5个双链寡核苷酸,分别是AP1、

OCT1、CREB、NF-kB、 TFIID结合位点的同源序列。这些寡核苷酸可以在末端标记后用作特异性探

针,或在竞争实验中用作非特异性探针。

 


4.  成功进行凝胶迁移实验,需要优化哪些因素?

 

凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速,但要成功地进行凝胶迁移实验,需要优化一些参数,这主要

受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素:抽提液的制备(核酸酶和

磷酸酶污染会使探针降解),结合蛋白的浓度,探针的浓度,非特异性探针的浓度,缓冲液的配方和pH,

聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件,保温时间和温度,载体蛋白,是否有辅助因子(比如锌,或镉等金

属离子,或激素)。总之,反应总体积应最小(20μl)。为满足一般要求,结合缓冲液含4%甘油,1mM MgCl2,

0.5mM EDTA,0.5mM DTT,50mM NaCl,10mM Tris-HCl(pH7.5), 0.05mg/ml poly dI:dC,或10mM HEPES

(pH7.9), 50mM KCl,1mM DTT, 1mM EDTA,10%甘油,0.05mg/ml poly dI:dC可作为优化实验的起始。

 


5.  在DNA探针的选择上,要考虑哪些重要因素?

 

目的DNA的长度应小于300bp,以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和

限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定,则应用短的寡核苷酸片段(约为25bp),

这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的

蛋白结合位点定位。随后可用DNaseI 印迹对蛋白结合的特异区域在DNA序列水平上作出分析。

 


6.  用以下一些转录调节因子和HeLa细胞核抽提物可形成哪些复合物:

AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。

 

当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白的来源时,每1个转录调节因子和它相关的DNA同源序列结合形成特征型的

结合形态。以下的文字描述了每一个单独的转录调节因子,包括识别的同源序列,因子的大小,特定的结合条件,

以及和HeLa细胞核抽提物可形成的复合物的数目。


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