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PCR聚合酶链式反应

发布时间:2015-03-31作者:器械科




聚合酶链式反应实验类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火(复性)--延伸三个基本反应步骤构成:

①模板DNA的变性:模板DNA经加热至90~95℃一定时聚合酶链式反应间后,使模板DNA双链或经pcr扩增形成的

双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55~60℃,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下,于70~75℃,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,

按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,

就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,

2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

 

聚合酶链式反应实验中退火温度是最重要的参数之一。在退火温度不太明确时,为了找到最优退火温度,可以使用梯度PCR。

温度梯度PCR是指在退火温度不太明确时,为了找到最优退火温度,在一台PCR仪上同时做多管PCR,每一管放在仪器内不同列

(有的是不同行)上,分别进行PCR(如50℃~60℃可以分6管,分别为50,52,54,56,58,60度),最后看看哪个温度的效果最好。

从而达到退火温度的优化。


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